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好心肝會刊肝病資訊

第89期

出刊日：2020-01-15

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液態切片研究正夯 抽血驗肝癌有譜？

近來，希望利用抽取血液或體液，就能檢查出癌症──所謂液態切片（Liquid Biopsy）的研究如雨後春筍，而在肝癌的應用上也有一些進展。不過，目前國內外的研究進度，要達到利用液態切片就能篩檢「早期」肝癌的目標，尚有很長一段路要走；用於肝癌病人是否復發的追蹤，則有機會較早實現！
 
諮詢／陳培哲（中研院院士、臺大醫院內科部暨醫學研究部主治醫師、臺大醫學院臨床醫學研究所教授）
撰稿／張雅雯
 
肝癌雖然已非國人十大癌症死亡排行榜首位，仍是第二名殺手。初期症狀不明顯、很難早期發現、早期治療，以及高復發率，都是肝癌死亡率仍舊居高不下的主要原因，所以醫界也在尋求是否有更好的方式可以早期發現肝癌。
 
腹部超音波判定因人而異
胎兒蛋白用於篩檢不夠精準
 
現行肝癌早期診斷的主要工具有兩種：一是腹部超音波，可檢查出3公分以內的早期肝癌，甚至1公分的腫瘤也有機會看得到，但已經是極限；然而這個檢查需耗費大量醫師人力，且容易受到操作者的經驗影響，導致檢查結果可能有差異，無法達到大規模篩檢的效益。
 
另一個工具就是抽血檢驗甲型胎兒蛋白（AFP），這種測定法很標準化，結果不會因人而異，但並非所有肝癌病人的甲型胎兒蛋白數值都會升高，早期肝癌更少升高，所以不能單靠此一數值來篩檢，臨床上多用於肝癌病人的術後追蹤，觀察是否復發。
 
因此，腹部超音波與甲型胎兒蛋白，都不算夠好的早期肝癌篩檢工具，即使對肝硬化這種高風險族群，每6個月甚至3個月做一次，仍有少數漏網之魚。
 
那麼，除了甲型胎兒蛋白以外，是否有其他生物標記，也可以篩檢出肝癌？的確有，日本透過抽血的方式，檢測了另外兩個肝癌腫瘤標記：異常凝血酶原（PIVKA-Ⅱ）以及胎兒蛋白的L3亞型，但大規模臨床研究發現，這兩種標記對篩檢出肝癌的效益增加有限，所以國內及歐美運用並不普遍。
 
ctDNA又稱癌症DNA指紋
開啟液態切片研究熱潮
 
目前主要的腫瘤標記大都是看腫瘤釋放出來的蛋白質，但因為這些蛋白質在正常細胞和腫瘤細胞都有，只是腫瘤細胞含量較多，就像肝癌的標記甲型胎兒蛋白在正常細胞也有，所以其實很難作為揪出肝癌的單一指標。
 
也因此，醫界近年來致力於研究「循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）」，又稱為腫瘤的DNA指紋。這是由腫瘤細胞染色體釋放到血漿中的DNA，攜帶有與原發腫瘤一致的分子遺傳學訊息。
 
進一步來說，正常細胞會變成腫瘤細胞，是因為基因突變一直累積的結果，所以正常細胞與腫瘤細胞最大的差別，就是這些突變的基因。腫瘤細胞會生長也會壞死，當它壞死時，腫瘤細胞的DNA就會釋放到血液中，所以，學理上來說，若能找到腫瘤細胞DNA特有的突變，就能用來區分正常細胞及癌細胞。
 
此類研究主要有幾個方向：
一是檢測ctDNA核苷酸的突變。ctDNA可反映腫瘤組織中的基因突變圖譜，也就是看它核苷酸序列的改變，比如有個核苷酸被其他取代？或是多了一個、少了一個核苷酸的變異。
 
二是檢測腫瘤細胞DNA的甲基化。若ctDNA核苷酸沒有突變、但是受到修飾，這屬於染色體表觀（epigenetics）的變化，例如甲基化。也就是從腫瘤釋放出的DNA，去看它甲基化的形式，是不是可當作癌症的指標。
 
抽血亦可檢測腫瘤釋放出的RNA
唯現階段只能定量
 
還有的研究是檢測腫瘤也會釋放到血液中的核糖核酸（RNA）。過去認為RNA比較不穩定、不太容易測定，現在已知有些微小的RNA（microRNA）可以保留比較久，所以也有人從檢測是否有腫瘤釋放出來的microRNA著手；有些RNA是包在細胞膜裡面，叫做外泌子（exosome），均可作為檢測目標。
 
例如日本有家公司近期也宣稱運用microRNA技術可以「一滴血檢驗13種癌症」，病人抽血後經過晶片檢測等步驟，若發現癌細胞特有的microRNA分泌量（濃度）增加，就能發現癌症。
 
這是一種「定量檢測」，不像循環腫瘤DNA檢測有明確的指標（檢測腫瘤特有的基因突變），所以萬一檢查出microRNA分泌量增加，也只知道可能有癌症，但不知道癌症在哪裡。根據報導，該技術現階段只能檢測出驗血者罹患了13種癌症中的至少一種，還無法確定是其中哪幾種。
 
該公司預計2020年以癌症患者為對象進行實證試驗，所以此技術是否真能用於臨床，還有待試驗結果出爐。
 
美國FDA授予突破性醫療器械認定
鼓勵投入ctDNA的臨床試驗
 
透過液態切片開發癌症早期篩檢的技術，最早在美國興起，陸續有些生物科技公司的產品研究獲得美國FDA授予「突破性醫療器械認定」，進而展開臨床試驗。比如有公司挑了20、30個基因，去比對腫瘤細胞與正常細胞的甲基化分布位置，嘗試鑑別出不同癌症的甲基化模式。
 
有的公司則運用NGS次世代定序來看ctDNA的核苷酸序列有沒有突變，這是大規模並平行地連續鑑定小片段DNA的基礎，知悉腫瘤突變資訊，可以預測臨床預後，並引導腫瘤演變的治療方向。
 
液態切片目前敏感度有限
仍無法用於早期癌症篩檢
 
然而，在看似一片欣欣向榮的研究背後，仍有許多困難亟待克服。首先，血液中的循環DNA（circulating DNA）裡面大多是正常體細胞壞死而來，腫瘤ctDNA在血液中的含量極微，並且混雜在更大量的正常游離DNA背景中，目前上述液態切片技術需腫瘤ctDNA佔所有循環DNA的百分之一到千分之一才能偵測出來。
 
舉例而言，以一個體重100公斤的人來說，腫瘤要一公斤（約10公分大），ctDNA才占到循環DNA的百分之一時才能診斷；算起來那可是一個很大的腫瘤，超音波早就可以看出來了。若液態切片可以做到千分之一，那技術已經很厲害，但腫瘤也要大約是100公克，換算起來腫瘤約3～4公分，也已超過早期大小。如果腫瘤這麼大才能透過液態切片檢驗出來，就無法達到早期篩檢的理想。
 
也就是說，液態切片若要達到早期篩檢的目的，必須要能做到ctDNA佔所有循環DNA的「萬分之一」的敏感度，這非常困難，也是現在ctDNA還無法用於早期篩檢癌症的最大癥結。
 
現在液態切片比較確定可運用於臨床的，就是追蹤中晚期癌症治療成效及是否復發。
 
臺大醫院打造
B肝肝癌術後復發追蹤檢測平台
 
肝癌是復發率很高的癌症，一般肝癌患者手術後1年，約3成會復發，因為手術只能切除看得到的腫瘤，但有些看不到的腫瘤細胞可能已經擴散出去，所以，ctDNA在肝癌病人手術後追蹤的應用，就是從其切除的腫瘤中找出其特有的基因突變，再檢測術後病患血液中還有沒有原來腫瘤的ctDNA，若有，表示還有腫瘤細胞存在，可能再復發。
 
這對於B型肝炎引起的肝癌特別有用，因為90%以上B肝病毒的DNA會嵌合到染色體裡面去，可以找B肝病毒跟人類染色體嵌合的片段（chimera DNA），這個病毒嵌合DNA可作為這一肝癌獨特的癌症DNA指紋。用這個嵌合的片段去設計一個獨有的ddPCR（droplet digital PCR），可以偵測釋放到血液中特有的ctDNA生物標記。ddPCR的優勢是目前最敏感的方法，可以測到佔所有循環DNA的「萬分之一」的ctDNA。
 
臺灣大學此項研究已經申請專利，並且於2016年技術轉移業界，打造國內「B肝肝癌術後復發追蹤檢測平台」。在先導臨床試驗中，收集了臺大醫院50名肝癌病患，在他們術後兩個月去檢驗血漿中是否殘留有跟腫瘤同樣突變的ctDNA，若有，1年再發率高達90%。接下來臺大、台北榮總、三總、林口長庚四大醫學中心，要進行更大規模的臨床試驗。
 
針對每一顆腫瘤「客製化」
 
每個病人的肝癌突變基因都不盡相同，即使是同一個病患，若幾年後再長出肝腫瘤，或肝臟長出不只一顆腫瘤，這些腫瘤的突變基因也可能不一樣。所以在檢測前，要看這幾顆腫瘤裡面B肝病毒跟人類染色體連接的片段的突變，是否都一樣，若不一樣，就要分別做ddPCR。也就是說，ddPCR這個方式不僅得針對每個肝癌病人，還得對每個病人的每一顆肝腫瘤予以「客製化」。
 
這個ddPCR檢驗方式目前適用於90% B肝病毒引起的肝癌，至於C肝病毒引起的肝癌，可用的ddPCR只適用於50%的病人。
 
這個技術平台預計未來還可以擴及做子宮頸癌篩檢，因為導致子宮頸癌最主要的HPV病毒，同樣會跑到染色體，現在用細胞學去檢測較耗費人力，若能去找有嵌入HPV病毒的DNA，就可以標準化檢測。
 
液態切片用於肝癌術後追蹤
盼更早得知復發情形
 
可以預期的是，使用液態切片可以更方便追蹤肝癌病人手術後的治療效果，以及早點得知是否復發，再給予因應的治療策略。比如透過液態切片發現仍有殘餘癌細胞，若在影像檢查下已經可以發現腫瘤，就給予相對應的治療（開刀或電燒等）；若還看不到腫瘤在哪裡，未來也許可以考慮使用PD-1等免疫療法，而不是等到肝腫瘤真的長出來了再治療，可能為時已晚。不過，這些必須等更大規模的臨床試驗結果出爐，才能真正應用在臨床上。
 
此外，此類技術若可行，讓病人能早點使用仍要符合法規，最近衛生福利部醫事司正研擬要把實驗室開發檢測（laboratory developed test, LDT）納入「特定醫療技術檢查檢驗醫療儀器施行或使用管理辦法（簡稱特管辦法）」，串連產官學研界攜手投入，讓新開發的癌症檢驗技術納入特管範圍，以早日造福病人。
 
（圖說：抽血檢驗循環腫瘤DNA原理）
體內若有腫瘤，腫瘤細胞會釋放DNA到血液中，稱為循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA），可做為腫瘤的基因指紋，因此可透過抽血檢驗是否有該腫瘤存在。
 
cfDNA和ctDNA是什麼？
當體內細胞凋亡或壞死，其中的DNA會釋放出來，隨著血液或體液循環，cfDNA（cell-free DNA）就是存在血液中游離的DNA片段，可能來自於腫瘤、也可能來自於正常細胞。而來自於腫瘤的稱作ctDNA（circulating tumor DNA），屬於高敏感性、高特異性的腫瘤標記物，相當於腫瘤細胞釋放到血液中的「身份指紋」，醫界認為這個腫瘤標記物可提供DNA核苷酸突變、表觀遺傳改變和其他形式的腫瘤特異性異常訊息。
 
液態切片vs組織切片
由於早期診斷肝癌的工具仍有改善空間，所以近年來有不少專家將肝癌的早期篩檢寄望於液態切片。與傳統組織切片比較，傳統組織切片看似準確仍有缺點，一是需透過開刀或用細針穿刺等侵入性方式才能取得腫瘤細胞；而且用在肝癌，也僅限於腫瘤長在肝臟的某些位置才有辦法執行。此外，腫瘤是很多細胞不斷增殖的結果，具異質性、每個細胞長得不太一樣，切片只能看到抽樣的那一部分，其實也無法涵蓋全部的腫瘤細胞。
 
由於腫瘤所有細胞的DNA都有可能釋放到血液中，因此液態切片幾乎可以「一網打盡」，等於是全部取樣，理論上會比切片更有代表性，這是最大的優點。此外，由於液態切片僅靠抽血，可反覆進行，還能反應腫瘤的整體情況，克服了組織切片的侷限性，理論上更適合用於用藥選擇、追蹤治療效果或了解抗藥性。
然而，液態切片目前若要用於篩檢包括肝癌在內的癌症，敏感度仍不夠高，這是最大的困境，也是亟待突破之處。

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